Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul
bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.
Teknik ini dipelopori pada tahun 1937 oleh ahli kimia Swedia Arne Tiselius
untuk pemisahan protein. Sekarang telah meluas ke banyak pemisahan kelas yang
berbeda lain dari biomolekul termasuk asam nukleat, karbohidrat dan asam amino.
Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan
dipisahkan.
Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan
listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika
molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian
dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka
molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan
gerak molekul tersebut tergantung pada muatan terhadap massanya serta tergantung
pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya
Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan
kondisi elektris lingkungan:
F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh
objek, E adalah medan listrik.Secara umum, elektroforesis digunakan untuk
memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA.
Jenis-Jenis Elektroforesis dan Cara Kerja
1. Elektroforesis Kertas
Kisah teknik pemisahan DNA/RNA ini berawal dari sekelompok
ilmuwan biokimia di awal tahun 1950-an yang sedang meneliti mekanisme molekular
DNA/RNA hidrolisis. Saat itu, tepatnya tahun 1952, Markham dan Smith
mempublikasikan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui mekanisme pembentukan zat
antara (intermediate) posfat siklik, yang kemudian menghasilkan nukleosida 2′-monoposfat
dan 3′-monoposfat. Ternyata mereka menggunakan suatu peralatan
yang dapat memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis tadi, salah satunya
yaitu nukleotida ‘siklik’ yang membawa pada kesimpulan bahwa hidrolisis RNA
terjadi melalui pembentukan intermediate posfat siklik. Peralatan itu dinamakan
‘elektroforesis‘, yang dibuat dari kertas saring Whatman nomor 3, sebuah tangki
kecil dan berbagai larutan penyangga (buffer). Nukleotida yang sudah terhidrolisis
ditaruh di atas kertas saring, kemudian arus listrik dialirkan melalui kedua
ujung alat elektroforesis.
Arus listrik yang dialirkan ini ternyata dapat memisahkan
campuran kompleks reaksi tadi menjadi komponen-komponennya, ini akibat adanya
perbedaan minor antara struktur molekul RNA yang belum terhidrolisis, zat
antara (intermediate) dan hasil reaksi (nukleosida 2′-monoposfat
dan nukleosida 3′-monoposfat) yang menyebabkan
mobilitas alias pergerakan mereka pada kertas saring berbeda-beda kecepatannya.
Karena pada akhir proses elektroforesis komponen tersebut terpisah-pisah,
sehingga dapat mengisolasi dan mengidentifikasi setiap komponen tersebut.
2. Elektroforesis Gel Kanji
Selanjutnya teknik elektroforesis dikembangkan untuk
memisahkan biomolekul yang lebih besar. Tahun 1955 Smithies mendemonstrasikan
bahwa gel yang terbuat dari larutan kanji dapat digunakan untuk memisahkan
protein-protein serum manusia. Caranya yaitu dengan menuangkan larutan kanji
panas ke dalam cetakan plastik, setelah dibiarkan mendingin kanji tersebut akan
membentuk gel yang padat namun rapuh. Gel kanji berperan sebagai fasa diam
(stationary phase) menggantikan kertas saring Whatman pada teknik terdahulu.
Ternyata elektroforesis gel yang diperkenalkan Smithies memicu para ilmuwan untuk
menemukan bahan kimia lain yang dapat digunakan sebagai bahan gel yang lebih
baik, seperti agarosa dan polimer akrilamida.
Dan penemuan elektroforesis gel kanji di awal karir Smithies membawanya
menerima hadiah nobel bidang kedokteran tahun 2007.
Teknik elektroforesis gel makin berkembang dan
disempurnakan, hingga 12 tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE =
Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi
akrilamida dan bis-akrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan campuran DNA/RNA
atau protein dengan ukuran lebih besar. Meskipun aplikasi elektroforesis makin
berkembang luas, namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan untuk
memisahkan DNA dengan ukuran yang super besar, misalnya DNA kromosom. Campuran
DNA kromosom tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka berbeda-beda.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar